c/ Đọc kết quả:
Vi khuẩn Gram dương: màu tím (tím gentian).
Vi khuẩn Gram âm: màu đỏ (đỏ Fucsin).
Hình ảnh não mô cầu: song cầu hạt cà phê bắt màu hồng đậm
3.2.2. Nuôi cấy phân lập vi khuẩn não mô cầu (N. meningitidis)
Môi trường và sinh phẩm cho nuôi cấy phân lập:
+ Môi trường thạch máu chín (sôcôla) hoặc thạch máu cừu 5% (BD BBL Co.,).
+ Canh thang tăng sinh (Trypticase soy hoặc BHI có 5% Fildes enrichment - BD BBL Co., hoặc tương đương.
+ Oxidase (tetramethyl-p-phenylenediamine hydrochloride – BD BBL hoặc tương đương).
+ Bộ môi trường CTA (Cystine Trypticase Agar): CTA không đường và CTA có chứa 1 trong 4 loại đường Maltose, Glucose (hoặc Dextrose), Lactose và Sucrose (của BD BBL CO., hoặc tương đương).
+ Bộ kháng huyết thanh A, B, C, Y, W135 (Ref: 30859602 ZL26; Wellcogen Bacterial Antigen Kit- Remel, UK hoặc tương đương).
Dụng cụ và trang thiết bị cho nuôi cấy phân lập, định danh:
+ Que cấy có vòng ăng to (10µl) và nhỏ (1µl)
+ Các loại ống nghiệm thủy tinh và nhựa (bảo quản mẫu)
+ Pipet chính xác và các loại đầu tip 10µl, 100µl
+ Máy ly tâm tốc độ từ 2000 – 15.000 vòng/phút
+ Máy trộn Vortex
+ Kính hiển vi
+ Tủ ấm thường với bình kín đốt nến hoặc tủ ấm CO2
Hình 1: tiêu bản nhuộm dịch não tủy
(bạch cầu đa nhân và các song cầu hạt cà phê nằm bên trong tế bào bạch cầu)
Hình 2: vi khuẩn N. meningitidis xếp đôi (song cầu hình hạt đậu)
Nuôi cấy dịch não tủy:
Sau khi ly tâm DNT (2.000 vòng/20 phút hoặc 3.000 vòng/10 phút), giữ lại phần ‘cặn’(100 - 200µl) để ria cấy trên thạch sôcôla hoặc thạch máu 5% và cấy vào canh thang tăng sinh:
*Cấy 0,01ml DNT sau ly tâm vào môi trường đặc (thạch sôcôla và thạch máu 5%), lấy 0,05ml nữa cấy vào 1 ống môi trường tăng sinh (canh thang Trypticase soy hoặc canh thang não tim (BHI) có bổ sung 5% Fildes enrichment- Hãng Becton Dickinson hoặc 5% Levinthal Base (là canh thang BHI có 20% máu cừu được xử lý ở nhiệt độ 800C trong 20 phút, ly tâm lấy dịch nổi). Ủ qua đêm ở 370C/5% CO2 và độ ẩm ≥ 50%.
Sau 16-24h nuôi cấy, quan sát khuẩn lạc trên môi trường thạch, nếu trên môi trường thạch âm tính, phải cấy chuyển từ ống canh thang tăng sinh sang 1 đĩa thạch máu 5% mới và/hoặc 1 đĩa thạch sô cô la mới vào các ngày thứ 2, 3 và thứ 7. Sau 7 ngày âm tính ở canh thang tăng sinh mới kết luận bệnh phẩm âm tính với não mô cầu.
Nuôi cấy máu:
Trong trường hợp bệnh nhân đang sốt, lấy vô khuẩn 3ml - 5ml, cấy ngay theo tỷ lệ 1: 5 (máu/canh thang nếu của trẻ em) và 1:10 (nếu của người lớn) (cấy vào canh thang Trypticase soy [TSB] hay Brain Heart Infusion [BHI] có bổ xung chất hỗ trợ vi khuẩn phát triển như 5% Fildes enrichment hoặc 5% Levinthal Base - là canh thang BHI có 20% máu cừu được xử lý ở nhiệt độ 800C trong 20 phút, ly tâm lấy dịch nổi) hoặc vào canh thang cấy máu thương phẩm (Bio-Rad hoặc BioMérieux Co.,). Ủ ở 370C/5% CO2 và độ ẩm ≥ 50%. Theo dõi sau ≥ 20h, nếu có biểu hiện vi khuẩn phát triển (môi trường cấy máu đục, váng...), cấy chuyển tiếp sang môi trường thạch máu cừu 5% và/ hoặc thạch sô cô la, ủ tiếp ở ở 370C/5% CO2 và độ ẩm ≥ 50% qua đêm.
Quan sát khuẩn lạc nghi ngờ: trên thạch máu cừu 5% và thạch sôcôla. Khuẩn lạc tròn vồng nhẹ, bờ đều và có màu xám (đường kính khoảng 1mm), một số chủng vi khuẩn khi cấy dày trên thạch máu có thể có màu trắng kem. Khuẩn lạc não mô cầu không gây tan huyết môi trường và không có mùi. Các khuẩn lạc có xu hướng liên kết với nhau, khi đó hơi có ánh xanh. Khuẩn lạc tan dễ dàng trong nước muối sinh lý, tuy nhiên, sau 24 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc trở nên dẻo dính là do não mô cầu tự ly giải, các chất nucleo-protêin đã thoát từ bên trong tế bào ra ngoài, lúc này nếu cấy chuyển thường thất bại vì phần lớn vi khuẩn đã chết.
3.2.3. Xét nghiệm định danh não mô cầu:
Nếu vi khuẩn phát triển trên các môi trường nuôi cấy (thạch máu 5% hoặc thạch sôcôla), nhặt khuẩn lạc nghi ngờ cấy thuần trên một đĩa thạch mới để nhuộm Gram xem hình thể và làm các thử nghiệm xác định sau đây:
Thử nghiệm oxidase:
Làm ướt thanh giấy lọc đã được sấy vô khuẩn từ trước bởi thuốc thử oxidase (tetramethyl-p-phenylenediamine hydrochloride), lấy que cấy nhựa (1µl) gặt 1 khuẩn lạc nghi ngờ và quệt lên thanh giấy đã tẩm thuốc thử oxidase, nếu vùng giấy được quệt vi khuẩn chuyển màu tím tía được đọc là dương tính (vi khuẩn có cytochrome oxidase - là một thành phần trong chuỗi hô hấp của vi khuẩn).
Thử nghiệm oxy hóa đường (Cystine Trypticase Agar (CTA):
Thử nghiệm phản ứng sinh hoá với 4 loại đường Glucose (hay Dextrose), Maltose, Lactose và Sucrose xác định đặc tính oxi hóa carbohydrate sinh axit của vi khuẩn (có đỏ phenol là chỉ thị màu) như sau:
- Cấy thuần vi khuẩn cần xác định là não mô cầu lên môi trường thạch máu cừu 5% hoặc thạch sôcôla 16-18 giờ.
- Lấy một vài khuẩn lạc cần xác định là não mô cầu lần lượt ria cấy sâu 10 mm vào các ống thạch CTA sau: CTA (không có đường), CTA + Glucose, CTA + Maltose, CTA + Lactose và CTA + Sucrose, mỗi lần cắm khuẩn lạc phải đổi ăng hoặc đốt ăng cấy.
- Đậy nắp những lọ hay ống nghiệm sinh hoá này, ủ ở tủ ấm 350C - 370C không có CO2.
Đọc kết quả sau 4-72 giờ. Sau 72 giờ nếu âm tính mới được hủy ống thử nghiệm.
Phản ứng dương tính (+) khi: phần trên của ống nghiệm sẽ thấy đục và chuyển màu vàng do não mô cầu sinh axit khi sử dụng đường glucose và maltose (theo kiểu ôxi hoá đường), nhưng không sử dụng đường lactose và sucrose.
Bảng 1. Đặc tính sử dụng đường của các loài Neisseria
Loài
|
Sinh axit từ
|
Glucose
|
Maltose
|
Lactose
|
Sucrose
|
N. meningitidis
|
+
|
+
|
-
|
-
|
N. gonorrhoeae
|
+
|
-
|
-
|
-
|
N. sicca
|
+
|
+
|
-
|
+
|
N. lactamica
|
+
|
+
|
+
|
-
|
Moraxella catarrhalis
|
-
|
-
|
-
|
-
|
Chú ý : Tuy nhiên có một tỷ lệ 3% não mô cầu không sử dụng Glucose và 10% não mô cầu không sử dụng Maltose
Hình 4. Phản ứng sinh hóa Cystine Trypticase Agar (bộ CTA)
Xác định typ huyết thanh (nếu có điều kiện):
Tuỳ theo cấu trúc kháng nguyên vỏ hay protein màng ngoài, não mô cầu có 13 typ huyết thanh. Typ huyết thanh được xác định bằng phản ứng ngưng kết trên phiến kính với kháng huyết thanh đặc hiệu, chú ý các typ A,B,C,Y, W135 như sau:
- Cấy thuần vi khuẩn não mô cầu (trên thạch máu hoặc sôcôla) qua đêm hoặc từ 8 – 12 giờ.
- Tạo huyền dịch vi khuẩn có độ đục tương đương độ đục 1 đến 2 Mc Farland trong nước muối sinh lý có 0,05% formalin.
- Lau sạch phiến kính bằng cồn và chia 3 ô (cho 3 chủng vi khuẩn hoặc cho 3 typ kháng thể).
- Đặt 15µl huyền dịch vi khuẩn gần trung tâm mỗi ô.
- Đặt 15µl kháng huyết thanh đặc hiệu bên cạnh huyền dịch vi khuẩn (sử dụng từng typ huyết thanh hoặc A hoặc B hoặc C).
- Dùng que nhựa hoặc tăm gỗ trộn đều.
- Theo dõi hiện tượng ngưng kết trong vòng 1 đến 2 phút tuỳ theo hướng dẫn của Nhà sản xuất sinh phẩm (thường phản ứng ngưng kết giữa vi khuẩn và kháng thể đặc hiệu xảy ra trong vòng 1 phút).
- Cần có chứng âm : vi khuẩn trộn trong nước muối sinh lý 0,5% formalin (không có hiện tượng ngưng kết).
3.3. Sơ đồ tóm tắt quy trình xét nghiệm
3.4. Tiêu chuẩn xác định vi khuẩn não mô cầu
- Đặc điểm khuẩn lạc: tròn vồng nhẹ, xám nhạt (gần giống khuẩn lạc vi khuẩn H. influenzae có vỏ) nhưng không có mùi đặc biệt, không gây tan huyết môi trường nuôi cấy. Não mô cầu phát triển được trên cả thạch máu (cừu hay thỏ) 5% và thạch sôcôla.
- Hình thể vi khuẩn: ở dạng song cầu hình hạt đậu hay hạt cà phê xếp úp vào nhau, bắt màu Gram âm (Hình 1,2).
- Thử nghiệm Oxidase: cytochrome oxidase (+).
-Thử nghiệm phản ứng sinh hoá 4 loại đường (vi khuẩn sử dụng carbohydrate sinh axit, đỏ phenol là chỉ thị màu):
*Glucose (+), Maltose (+): màu vàng.
*Lactose (-), Sucrose (-): màu đỏ.
3.5. Chú ý:
Điều kiện nuôi cấy để phân lập não mô cầu:
*Nhiệt độ 35-370C/ 5% C02/ 50% độ ẩm. Sử dụng tủ ấm C02 hoặc tủ ấm thường và bình kín đốt nến. Đọc kết quả phân lập sau 16-24h.
Chú ý: Nếu có điều kiện để phát hiện kháng nguyên đặc hiệu hoặc gen đặc hiệu của não mô cầu, ly tâm dịch não tủy 15.000 vòng x 10 phút, dịch nổi sau ly tâm xử lý ở nhiệt độ 1000C/3’ và thực hiện phản ứng ngưng kết phát hiện kháng nguyên não mô cầu các typ A,B,C, W135 và Y. Phần “cặn” cất ở -700C để xử lý tách chiết ADN của vi khuẩn thực hiện PCR (nếu nuôi cấy âm tính hoặc có thể thực hiện ngay PCR với phần ”cặn”cùng thời gian với nuôi cấy phân lập).
4. Báo cáo kết quả (phiếu trả lời kết quả):
5. Kiểm soát chất lượng:
Để kiểm soát chất lượng cần đảm bảo:
- Có chủng vi khuẩn chuẩn (để kiểm soát chất lượng các điều kiện phân lập vi khuẩn từ bệnh phẩm).
- Môi trường nuôi cấy phân lập và sinh phẩm xác định phải còn hạn và được giữ theo đúng những yêu cầu về điều kiện bảo quản của Nhà sản xuất.
- Môi trường nuôi cấy phân lập và sinh phẩm xác định phải được kiểm tra chất lượng ngay sau khi nhận về hoặc ngay sau khi pha chế (đối với môi trường nuôi cấy phân lập).
- Đảm bảo các điều kiện phát triển của vi khuẩn trong quá trình ủ (nhiệt độ, khí trường…).
- Bệnh phẩm được lấy và bảo quản đúng cách.
- Có sổ sách ghi chép quá trình làm xét nghiệm (nhật ky phòng xét nghiệm).
6. Các yêu cầu về an toàn:
Tuân thủ các yêu cầu về an toàn sinh học cho người thực hiện và môi trường làm việc:
- Nơi thực hiện xử lý mẫu phải được cách ly với khu vực bàn giấy văn phòng.
- Người thực hiện trong quá trình làm việc phải có quần áo, mũ, khẩu trang, găng tay y tế.
- Các dụng cụ (ăng cấy, pipet…) hoặc được đốt qua đèn cồn hoặc phải được ngâm trong dung dịch khử trùng ngay sau khi thực hiện hoặc bỏ ngay vào túi rác chuyên dụng.
- Lau dọn vệ sinh khử trùng khu vực xử lý mẫu bệnh phẩm bằng hóa chất thích hợp ngay sau khi kết thúc xét nghiệm.
7. Chất thải phát sinh và phương pháp xử lý (tóm tắt)
- Bệnh phẩm và/hoặc chất đựng bệnh phẩm, dụng cụ xét nghiệm dùng 1 lần: sau khi xét nghiệm xong phải được cho vào thùng khử trùng chuyên dụng để khử trùng trước khi thải bỏ.
- Môi trường nuôi cấy bệnh phẩm: sau khi đã có kết quả phân lập phải được tập trung vào các thùng đựng chuyên dụng để hấp sấy khử trùng.
8. Tài liệu tham khảo
1. Josephine A. Morello, William M. Janda, and Gary V. Doern. Neisseria and Branhamella. (1991) Manual of Clinical Microbiology Fifth Edition. 258-276.
2. Robert S. Baltimore and Harry A. Feldman. (1991) Meningococcal Infections. Bacterial Infection of Human Epidemiology and Control, second edition p. 425- 440.
3.WHO/CDS/CSR/EDC/99.7.(1999). Identification of N. meningitidis. Laboratory Manual for the Diagnosis of meningitis Caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae. page 19-22.